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Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 444 (2023) Citer cet article

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Les mélanomes métastasent fréquemment vers des organes distants et en particulier les métastases intracrâniennes représentent toujours un défi clinique majeur. On pense que la reprogrammation épigénétique des métastases intracrâniennes est impliquée dans l'échec du traitement, mais jusqu'à présent, on ne sait que peu de choses sur les différences de méthylation de l'ADN spécifiques au patient entre les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes. Le regroupement hiérarchique des méthylomes de 24 paires de métastases de mélanome intra- et extracrâniennes appariées par des patients a révélé que les métastases intra- et extracrâniennes de patients individuels étaient plus similaires les unes aux autres qu'aux métastases dans le même tissu d'autres patients. Par conséquent, une analyse personnalisée de chaque paire de métastases a été effectuée par un modèle de Markov caché pour classer les niveaux de méthylation des CpG individuels comme diminués, inchangés ou augmentés dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux extracrâniennes. Les altérations prédites de la méthylation de l'ADN étaient très spécifiques au patient, différant par le nombre et les états de méthylation des CpG altérés. Néanmoins, quatre observations générales importantes ont été faites : (i) les métastases intracrâniennes de la plupart des patients montraient principalement une réduction de la méthylation de l'ADN, (ii) la signalisation des cytokines était le plus souvent affectée par la méthylation différentielle dans les paires de métastases individuelles, mais aussi MAPK, PI3K/Akt et la signalisation ECM étaient souvent altérées, (iii) les gènes fréquemment affectés étaient principalement impliqués dans la signalisation, la croissance, l'adhésion ou l'apoptose, et (iv) un enrichissement des termes fonctionnels liés aux activités des canaux et des transporteurs soutient les découvertes précédentes pour un phénotype de type cérébral. De plus, l'ensemble dérivé de 17 gènes de la voie de signalisation qui distinguaient les métastases intra-crâniennes des métastases extracrâniennes chez plus de 50 % des patients comprenait des oncogènes bien connus (par exemple PRKCA, DUSP6, BMP4) et plusieurs autres gènes connus des troubles neuronaux (par exemple EIF4B, SGK1, CACNG8). De plus, les associations d'altérations de la méthylation du corps génique avec les changements d'expression génique correspondants ont révélé que les trois gènes de la voie de signalisation JAK3, MECOM et TNXB diffèrent fortement dans leur expression entre les métastases intra- et extracrâniennes appariées par le patient. Notre analyse contribue à une caractérisation approfondie des différences de méthylation de l'ADN entre les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes appariées par les patients et peut fournir une base pour de futures études expérimentales afin d'identifier des cibles pour de nouvelles approches thérapeutiques.

Les mélanomes représentent la forme la plus agressive de cancer de la peau et leur fréquence a augmenté au cours des dernières années1,2,3. Le développement du mélanome est déclenché par des mutations de l'ADN dans les mélanocytes, qui sont principalement induites par le rayonnement solaire ultraviolet4. En particulier, les mutations BRAF sont fréquemment impliquées dans le développement des mélanomes en améliorant la prolifération cellulaire par une activation incontrôlée de la voie de signalisation MAPK5,6,7. Les mélanomes métastasent aussi fréquemment dans d'autres organes comme les ganglions lymphatiques, les poumons, le foie ou le cerveau3,8. En fait, des métastases intracrâniennes sont observées chez environ 50 % des patients atteints de mélanome métastatique9 et sans traitement, les patients atteints ne survivent en moyenne qu'environ quatre mois10.

Il existe plusieurs options de traitement pour le mélanome métastatique, notamment les inhibiteurs de BRAF et de MEK ou les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire11,12. Ces thérapies approuvées améliorent considérablement la survie des patients présentant des métastases extracrâniennes13,14,15. Cependant, pour les métastases intracrâniennes, la durée de réponse des inhibiteurs de BRAF/MEK est limitée à quelques mois et l'efficacité des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire est considérablement réduite chez les patients symptomatiques9,16,17,18,19,20. Ainsi, les métastases intracrâniennes sont la principale cause de décès chez les patients atteints de mélanome21. Par conséquent, des connaissances plus détaillées sur les différences moléculaires entre les métastases intra- et extracrâniennes sont nécessaires pour fournir une meilleure base pour le développement de stratégies thérapeutiques pour les métastases intracrâniennes.

Au cours des dernières années, plusieurs études ont été réalisées pour mieux comprendre les différences entre les métastases intra- et extracrâniennes au niveau moléculaire. Trois études ont identifié une régulation à la hausse de la voie PI3K/Akt dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes22,23,24. Plusieurs études ont analysé le paysage des mutations génétiques avec des résultats différents. Récemment, il a été prédit que les gènes (par exemple ARID1A, ARID2, SMARCA4, BAP1 et BRAF) différaient dans leur statut mutationnel entre les métastases intra-crâniennes et extracrâniennes6, alors qu'une autre étude plus ancienne avait rapporté un paysage mutationnel inchangé entre les deux types de métastases22. De plus, les métastases intra- et extracrâniennes ont également été comparées au niveau de l'expression génique22,25 et au niveau des altérations du nombre de copies d'ADN22. De plus, une étude qui a utilisé un modèle de métastase cérébrale de mélanome a décrit un phénotype de mélanome de type neurone suggérant que le micro-environnement cérébral joue un rôle important dans l'adaptation des cellules de mélanome métastatique au cerveau26. Une vue plus générale des métastases dans le micro-environnement cérébral a été obtenue par une étude récente sur le transcriptome unicellulaire qui a découvert deux archétypes généraux de métastases cérébrales humaines : un archétype prolifératif et un archétype inflammatoire, qui sont façonnés par des interactions tumeur-immunité27.

De plus, il a été rapporté que des altérations épigénétiques jouent un rôle important dans la formation de métastases28,29,30. Les changements de méthylation de l'ADN dans les régions promotrices sont bien connus pour modifier directement l'expression des gènes affectés31, mais également les changements de méthylation de l'ADN dans d'autres régions génomiques comme les activateurs ou les corps de gènes peuvent influencer l'expression des gènes32,33,34. Deux études portant sur des métastases de mélanome chez différents patients ont révélé une forte hétérogénéité entre les profils de méthylation de l'ADN des métastases intra- et extracrâniennes35,36. Il est très probable qu'une grande partie de cette hétérogénéité épigénétique puisse être attribuée au fait que les métastases de différents patients avaient été comparées. Pour tenir compte de cette hétérogénéité inter-patients, une analyse comparative des profils de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome des paires de métastases intra- et extracrâniennes appariées par les patients pourrait aider à mieux caractériser les différences de méthylation de l'ADN afin d'améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires qui peuvent contribuer à résistance thérapeutique. Le potentiel d'une telle approche a récemment été démontré pour d'autres couches omiques en comparant les profils transcriptomique25 et génomique6 de paires de métastases intra- et extracrâniennes appariées par des patients. De plus, des analyses appariées des profils de méthylation de l'ADN des lignées cellulaires de mélanomes métastatiques et primaires ont identifié des gènes conducteurs qui contribuent à la formation de métastases37,38.

Ici, nous analysons les profils de méthylation de l'ADN de paires de métastases de mélanome appariées par des patients à partir de métastases intra- et extracrâniennes. Pour tenir compte de l'histoire de développement commune des métastases appariées au patient, une approche de modèle de Markov caché (HMM) est envisagée pour l'analyse personnalisée des profils de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome des paires de métastases spécifiques au patient. Les différences de méthylation prédites sont analysées plus en détail dans le contexte d'éléments génomiques fonctionnels connus, de voies de signalisation pertinentes pour le cancer et de méta-informations cliniques. En outre, les gènes les plus fréquemment modifiés chez tous les patients ont été analysés de manière intensive sur la base d'ontologies génétiques, d'informations sur les voies et d'études de la littérature pour dériver un ensemble de gènes candidats potentiels pour les voies clés qui pourraient être impliqués dans la manifestation des différences entre les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes. Notre étude contribue à une meilleure caractérisation des différences de méthylation de l'ADN entre les métastases intra- et extracrâniennes et peut aider à sélectionner des cibles moléculaires potentielles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les métastases intracrâniennes.

Notre ensemble de données représente les profils de méthylation à l'échelle du génome des métastases de mélanome intra- et extracrâniennes appariées par les patients de 14 patients (tableau supplémentaire S1). Les métastases extracrâniennes comprennent les ganglions lymphatiques, les poumons, le foie, la peau et les tissus mous (tableau 1). Pour sept patients, plusieurs échantillons provenant de régions histologiquement différentes ont été prélevés sur la même métastase. Pour obtenir un aperçu global des similitudes et des différences des métastases individuelles, une analyse de regroupement hiérarchique a été effectuée pour les méthylomes mesurés à l'échelle du génome (Fig. 1). Pour la grande majorité des échantillons, ce regroupement a montré que les métastases d'un même patient étaient beaucoup plus similaires entre elles qu'aux métastases du même tissu d'autres patients. Le regroupement hiérarchique a également révélé deux sous-groupes majeurs. Dans la plupart des cas, tous les échantillons d'un patient individuel ont été regroupés dans l'un des deux sous-groupes, à l'exception des patients P17, P39 et P67, dont les métastases intra- et extracrâniennes étaient réparties sur les deux principaux sous-groupes. Dans l'ensemble, pour 4 des 14 patients (P09, P17, P39, P67), leurs métastases intra-crâniennes et extracrâniennes correspondantes n'étaient pas directement regroupées. Les métastases intracrâniennes, ganglionnaires et pulmonaires, qui étaient disponibles chez plus de deux patients, étaient présentes dans les deux principaux sous-groupes. Les métastases hépatiques et cutanées faisaient exclusivement partie du sous-groupe majeur gauche, tandis que les métastases des tissus mous étaient exclusivement retrouvées dans le sous-groupe majeur droit (Fig. 1).

Similitude des méthylomes des métastases de mélanome spécifiques au patient. Regroupement hiérarchique des profils de méthylation à l'échelle du génome de 16 métastases intra- et 21 extracrâniennes de 14 patients (tableau 1). Les échantillons de métastases spécifiques au patient sont regroupés dans presque tous les cas, indépendamment du type de tissu dans lequel les métastases étaient localisées. Ce regroupement de métastases de mélanome spécifique au patient plutôt qu'au tissu est donné par l'ordre des étiquettes de métastases et illustré par le dégradé de couleur du patient sous le dendrogramme. Les échantillons de quatre patients qui ne se sont pas regroupés sont marqués d'un astérisque '*'. Les différents tissus à partir desquels les métastases ont été prélevées sont codés dans les étiquettes des métastases et mis en évidence par le code couleur des tissus sous le dendrogramme (gris : cerveau, vert : ganglion lymphatique, bleu : poumon, rose : foie, jaune : peau, violet : tissus mous ). Le nombre rouge au-dessus de chaque sous-groupe dans le dendrogramme représente la valeur p approximative non biaisée (valeur AU) déterminée par bootstrap, où une valeur de 100 signifie que le sous-groupe correspondant était complètement stable.

De plus, une analyse de stabilité supplémentaire basée sur le bootstrap39 du regroupement hiérarchique a confirmé que les tendances observées étaient très robustes. Toutes les valeurs AU, sauf une, étaient de 100 (Fig. 1). Ces résultats indiquent clairement que les méthylomes de métastases spécifiques au patient provenant de tissus intra- et extracrâniens ont tendance à être plus similaires les uns aux autres que les méthylomes correspondants de métastases dans le même tissu d'autres patients. Des résultats similaires ont été observés pour les données d'expression génique des métastases de mélanome25. Ainsi, motivée par le regroupement observé d'échantillons de métastases spécifiques au patient, une analyse comparative ciblée des méthylomes de chaque paire de métastases individuelles a été réalisée comme prochaine étape pour prédire les altérations qui distinguent les métastases intra-crâniennes des métastases extracrâniennes.

Pour réaliser une analyse spécifique au patient des paires de métastases individuelles, nous avons d'abord calculé les profils de rapport log\(_2\) à l'échelle du génome pour chaque paire de métastases spécifiques au patient. Un tel profil de rapport log \ (_2 \) quantifie pour chaque CpG la différence de méthylation spécifique à la paire pour la métastase intracrânienne par rapport à la métastase extracrânienne correspondante (tableau supplémentaire S2). Ces profils de méthylation ont été utilisés pour effectuer une analyse d'autocorrélation afin de déterminer la similitude des altérations de la méthylation à proximité chromosomique (Fig. 2). Les fortes corrélations positives observées des mesures voisines ont motivé l'utilisation d'un modèle de Markov caché (HMM) pour une analyse comparative des méthylomes de chaque paire de métastases individuelles, car les HMM modélisent les dépendances chromosomiques locales des mesures pour obtenir des prédictions fiables des états sous-jacents (par exemple40, 41,42). Par conséquent, nous avons utilisé un HMM de premier ordre standard à trois états spécifiquement adapté pour la prédiction des altérations de la méthylation dans les paires de métastases individuelles40 (voir "Méthodes" pour plus de détails). Ce modèle a classé chaque CpG dans une paire de métastases en fonction de son état de méthylation sous-jacent le plus probable, garantissant une interprétation biologiquement significative : (i) diminution de la méthylation "-", (ii) méthylation inchangée "\(=\)", ou (iii) augmentation méthylation "\(+\)" dans l'intra- par rapport à la métastase extracrânienne. Il a déjà été démontré que l'approche HMM surpasse les autres modèles pour la prédiction des CpG altérés dans les profils de méthylation de l'ADN40. La possibilité d'analyser individuellement chaque paire de métastases spécifiques au patient rend cette approche parfaitement adaptée pour tenir compte de l'histoire de développement commune des paires de métastases appariées au patient reflétées dans leurs profils de méthylation de l'ADN.

Similitudes locales des mesures des CpG voisins dans les profils de méthylation. Autocorrélations des altérations de la méthylation des profils de méthylation log\(_2\) spécifiques au patient comparant les métastases intra-crâniennes aux métastases extracrâniennes correspondantes. Les autocorrélations ont été calculées par chromosome pour tous les échantillons pour les profils de rapport log\(_2\) initialement mesurés (rouge) et pour les profils de rapport log\(_2\) permutés au hasard (noir). Les autocorrélations médianes sont tracées sur l'axe des y par rapport au décalage de position des CpG voisins dans les profils de rapport log\(_2\) (axe des x). Les quantiles correspondants des autocorrélations atteintes sont en outre indiqués pour les profils d'origine (bandes colorées autour de la courbe rouge), ce qui les distingue clairement du modèle de contrôle de permutation aléatoire, qui a été construit sur la base de 1000 profils permutés au hasard dérivés des méthylomes mesurés à l'origine.

Les prédictions basées sur le HMM sont résumées à la Fig. 3A pour chaque paire de métastases individuelles et fournies plus en détail dans le tableau supplémentaire S3. Les paires de métastases individuelles ont été triées en fonction des tissus dans lesquels la métastase extracrânienne s'est produite. La plupart des paires de métastases appartenaient au groupe cerveau contre poumon (10 paires) suivi de cerveau contre ganglion lymphatique (7 paires), cerveau contre peau (3 paires), cerveau contre tissus mous (3 paires) et cerveau contre foie (1 paire) . En moyenne sur toutes les paires, 7,8 % des CpG mesurés ont montré une diminution de la méthylation et 3,4 % ont montré une augmentation de la méthylation dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes, alors que la grande majorité des 88,8 % des CpG ne différaient pas. Dans l'ensemble, les paires de métastases individuelles de différents patients ont montré des nombres assez différents de CpG altérés. Plusieurs paires de métastases ont montré beaucoup plus de CpG avec une méthylation réduite que de CpG avec une méthylation accrue (P08, P39, P17), mais certaines paires contenaient également nettement plus de CpG avec une méthylation accrue que réduite (P67 et paire P06-BLym-1). D'autres paires n'ont montré que très peu de différences de méthylation entre les métastases intracrâniennes et extracrâniennes et leurs nombres de CpG avec une méthylation diminuée ou augmentée étaient comparables (par exemple P03, P09, P16, P18). Généralement, ces différences de méthylation prédites étaient indépendantes du type de tissu des métastases extracrâniennes. Les groupes cerveau contre poumon et cerveau contre ganglion lymphatique contenaient chacun des paires appartenant aux deux extrêmes. Comme prévu, plusieurs paires d'un même patient ont principalement montré des nombres similaires de CpG avec une méthylation diminuée ou augmentée (P04, P08, P17, P18, P67), mais pour deux autres patients (P06, P42) également des déviations légèrement plus fortes de leurs multiples paires ont été observés.

Vue d'ensemble des changements de méthylation des paires de métastases individuelles. Résumé spécifique au patient des prédictions basées sur le HMM des états de méthylation des CpG individuels. Les paires de métastases spécifiques au patient sont triées selon le tissu dans lequel la métastase extracrânienne s'est produite (axe des x) avec cerveau contre poumon (bleu), cerveau contre ganglion lymphatique (vert), cerveau contre peau (jaune), cerveau contre tissus mous ( violet) et cerveau contre foie (rose). (A) Nombre total de CpG différentiellement méthylés qui devraient avoir une méthylation diminuée (barres bleues descendantes à partir de 0) ou augmentée (barres rouges ascendantes à partir de 0) dans la paire de métastases spécifiques au patient correspondantes. (B) Pourcentage de CpG avec une méthylation diminuée ou accrue située dans des éléments génomiques fonctionnels avec un accent sur les corps géniques, les promoteurs et les activateurs pour chaque paire de métastases. (C) Pourcentage de CpG méthylés augmentés et diminués des voies de signalisation les plus fréquemment affectées. L'enrichissement significatif d'une catégorie génomique est marqué d'un « x » rouge dans les sous-panneaux (B) et (C) (valeur de p ajustée au FDR < 0,05).

Tous ces patients présentant plusieurs paires de métastases ont été analysés plus en détail pour déterminer dans quelle mesure les paires diffèrent dans leurs profils de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome chez le même patient et entre les patients. Le regroupement hiérarchique en combinaison avec le bootstrap a montré que plusieurs paires de régions histologiques différentes de métastases spécifiques au patient formaient toutes des sous-groupes complètement stables pour les patients individuels (Fig. S1A supplémentaire). Plusieurs paires de patients différents qui avaient leurs métastases extracrâniennes dans le même tissu (paires cerveau contre poumon : P18, P67 ; paires cerveau contre ganglions lymphatiques : P06, P17, P42) étaient réparties sur le dendrogramme en grappes et ne formaient pas de sous-grappes plus grandes selon le type de tissu dans lequel les métastases extracrâniennes se sont produites. Le regroupement stable observé de plusieurs paires de différentes régions histologiques de métastases spécifiques au patient est également resté complètement stable lorsque toutes les autres paires de patients appariées sans plusieurs échantillons ont été incluses (Fig. S1B supplémentaire). Ceci est également étayé par la conformité médiane des prédictions basées sur HMM des états de méthylation spécifiques de CpG individuels, qui était significativement plus élevée pour plusieurs paires d'un même patient qu'entre des paires de patients différents (test de somme des rangs de Wilcoxon : \(p = 0,0000931\), conformités médianes : 88,77 contre 81,96, tableau supplémentaire S4).

Ainsi, en combinaison avec le co-clustering observé d'échantillons spécifiques au patient (Fig. 1, Fig. S1 supplémentaire), les paires spécifiques au patient de la même métastase mais de différentes régions histologiques ont tendance à avoir des altérations très similaires du méthylome. Globalement, les patients individuels diffèrent plus fortement dans leurs méthylomes.

Pour identifier les éléments génomiques affectés par les altérations de la méthylation, nous avons analysé les prédictions basées sur le HMM à l'échelle du génome des CpG avec une diminution et une augmentation de la méthylation pour les paires de métastases individuelles dans le contexte d'annotations génomiques fonctionnelles axées sur les promoteurs, les corps de gènes et les activateurs (Fig. .3B). Le nombre de CpG modifiés dans ces catégories fonctionnelles suivait de près le nombre observé de CpG modifiés dans des paires individuelles (Fig. 3A – B). Un enrichissement significatif des CpG modifiés a été principalement trouvé dans les CpG situés dans les régions activatrices (21 sur 24 paires, Fig. 3B). En outre, 10 des 24 paires ont montré un enrichissement en CpG altérés dans les corps de gènes et 4 des 24 paires ont montré un enrichissement en CpG altérés dans les régions promotrices (Fig. 3B). Tous ces enrichissements ont été observés pour les CpG qui ont montré une diminution de la méthylation dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes, à l'exception de P08 et P17, qui ont également montré un enrichissement des CpG avec une méthylation accrue dans les métastases intracrâniennes pour les activateurs. Des tendances similaires ont été observées pour d'autres catégories fonctionnelles, notamment les îles CpG, les côtes, le plateau et les régions de haute mer (Fig. S2B supplémentaire), où un enrichissement significatif a été observé pour toutes les catégories, mais le plus souvent dans les régions de haute mer. En outre, conformément aux mécanismes d'activation connus43, un enrichissement significatif de la diminution de la méthylation dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes a été observé pour les éléments transposables (Fig. S2C supplémentaire). Les plus fréquemment altérés étaient les rétrotransposons LTR avec un enrichissement significatif dans 12 échantillons, l'élément nucléaire intercalé long (LINE) dans 9 échantillons et les transposons d'ADN dans 8 échantillons.

En outre, nous avons également analysé comment les CpG de gènes faisant partie de voies de signalisation connues pertinentes pour le cancer étaient affectés par des altérations de la méthylation dans des paires de métastases individuelles spécifiques au patient (Fig 3C, Fig. S2A supplémentaire). La figure 3C résume les résultats pour les voies de signalisation dont les gènes ont été enrichis de manière significative avec des CpG modifiés en huit paires ou plus. Les gènes de la voie d'interaction des récepteurs des cytokines, pour lesquels 14 des 24 paires ont montré une méthylation significativement altérée entre les métastases intra- et extracrâniennes, ont été les plus fréquemment touchés (augmentation de la méthylation dans les métastases intracrâniennes : P17-BLym-2 ; diminution de la méthylation dans les métastases intracrâniennes : P03- BLun, P16-BLun, P18-BLun-1/2, P08-BSof-2/3, P42-BLym-2, P04-BSki-1/2, P06-BLym-1/2, P02-BLym et P67- BLun-4). Cet enrichissement a été observé par rapport à tous les types de tissus extracrâniens, à l'exception du tissu hépatique (P09-BLiv), indiquant potentiellement un rôle important de la voie d'interaction des récepteurs des cytokines dans le développement et la manifestation de métastases intracrâniennes. La deuxième voie la plus fréquemment affectée était la signalisation MAPK. Les gènes de cette voie étaient significativement enrichis dans 11 des 24 paires de métastases avec une forte surreprésentation de la diminution de la méthylation dans les métastases intracrâniennes (augmentation de la méthylation dans les métastases intracrâniennes : P04-BSki-1 ; diminution de la méthylation dans les métastases intracrâniennes : P03-BLun, P06-BLym , P08-BSof-2/3, P09-BLiv, P17-BLym-2, P18-BLun-2, P39-BLun et P42-BLym-1/2). L'enrichissement correspondant a été observé par rapport à tous les types de tissus de métastases extracrâniennes, y compris le tissu hépatique. De plus, les gènes de la voie d'interaction des récepteurs ECM ont été significativement enrichis pour la méthylation altérée dans 10 des 24 paires, mais cette fois la proportion de paires avec une méthylation accrue dans les métastases intracrâniennes était presque aussi importante que celle des paires avec une méthylation diminuée (méthylation accrue dans métastases intracrâniennes : P02-BLym, P04-BSki-2 et P06-BLym-2 ; diminution de la méthylation : P08-BSof-2/3, P17-BLym-2, P18-BLym-2, P42-BLym-2 et P67- BLun-3/4). Encore une fois, ces enrichissements ont été observés par rapport à tous les types de tissus extracrâniens, à l'exception du tissu hépatique (P09-BLiv). De plus, les gènes de la voie de signalisation PI3K/Akt ont montré un enrichissement significatif des CpG avec une diminution de la méthylation dans les tissus intracrâniens pour 8 des 24 paires de métastases appariées (P03-BLun, P08-BSof-1, P17-BLym-2, P18- BLun-2, P39-BLun, P64-BLun, P67-BLun-2), à l'exclusion des paires où la métastase extracrânienne s'est produite dans les tissus mous ou le foie. Dans l'ensemble, des altérations de la méthylation des CpG associées aux gènes de la voie de signalisation ont été observées pour la grande majorité des paires. Seules deux paires n'ont montré aucun enrichissement significatif de la méthylation différentielle dans des voies de signalisation spécifiques (P28-BSki, P67-BLun-2).

Les méta-informations cliniques disponibles sur le temps entre les résections chirurgicales des métastases appariées par les patients, les traitements reçus et la survie après l'apparition de la métastase intracrânienne des patients (tableau supplémentaire S5) ont été prises en compte pour analyser si les altérations de méthylation prédites entre les paires appariées par les patients des métastases intra- et extracrâniennes étaient associées à des caractéristiques cliniques spécifiques. Dans une première approche, le nombre total de CpG différentiellement méthylés prédits par HMM a été analysé en relation avec chacune de ces trois caractéristiques cliniques. Le délai entre la résection chirurgicale des deux métastases était inférieur à 10 mois pour 12 des 14 patients. Dans ces délais très similaires, des nombres assez différents d'altérations de la méthylation de l'ADN ont été observés, allant de moins de 25 000 à plus de 225 000 CpG altérés dans notre cohorte (Fig. 4A). De plus, rien n'indiquait que les traitements médicamenteux des patients après l'apparition de la première métastase aient eu un impact sur le nombre de CpG altérés (Fig. 4B). Plus en détail, le patient avec le plus petit et le patient avec le plus grand nombre de CpG altérés n'ont pas été traités. Les patients ayant reçu un traitement se situaient entre ces extrêmes se chevauchant avec d'autres patients non traités. De plus, le nombre ou l'état des CpG altérés n'a pas eu d'impact sur la survie à partir de la survenue d'une métastase intracrânienne (Fig. 4C). Dans une deuxième approche, il a été analysé si les CpG les plus discriminants entre les métastases intra- et extracrâniennes appariées différaient dans leurs états de méthylation entre les patients non traités et traités. Cela a d'abord été fait en considérant les 14 CpG de premier rang qui ont montré une diminution ou une augmentation de la méthylation chez au moins 10 des 14 patients (tableau supplémentaire S6, 1 CpG avec augmentation et 13 CpG avec diminution de la méthylation dans les paires de métastases intra-crâniennes par rapport aux extracrâniennes) . Dans l'ensemble, la majorité de ces CpG présentaient des proportions similaires d'altérations de la méthylation chez les patients non traités et traités (Fig. S3 supplémentaire). Plus en détail, les trois patients qui ont reçu un traitement contre les deux métastases avant la résection chirurgicale ont montré des altérations de ces CpG de premier rang. À l'exception de quatre CpG, les CpG de rang supérieur ont également été modifiés de la même manière chez au moins un des deux patients qui n'ont reçu un traitement qu'avant la résection de la métastase intracrânienne et au moins cinq des huit patients non traités ont également montré les mêmes altérations de ces CpG. Ces chiffres sont restés largement stables lorsque le critère de sélection a été davantage assoupli pour les 661 CpG qui ont montré une diminution ou une augmentation de la méthylation chez au moins 8 des 14 patients (tableau supplémentaire S6). Ainsi, les CpG de premier rang les plus discriminants ont montré des altérations de méthylation plutôt homogènes pour les patients traités et non traités et ont tendance à représenter des candidats marqueurs plus généraux pour distinguer les métastases intra-crâniennes des extracrâniennes.

Altérations de la méthylation dans le contexte de l'information clinique. Visualisation du nombre de CpG différentiellement méthylés entre les métastases intra- et extracrâniennes (axe des x) dans le contexte des différentes informations cliniques de chaque patient (axe des y). Le codage couleur des symboles tracés définit si les changements de méthylation incluent plus de CpG avec une méthylation accrue (rouge) ou plus de CpG avec une méthylation diminuée (bleu) dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux extracrâniennes. Les formes des symboles tracés mettent en évidence l'état du traitement des patients individuels après l'apparition d'une métastase. (A) Nombre de CpG différentiellement méthylés dans le contexte du temps entre les deux métastases d'un patient. Un temps négatif signifie que la métastase intracrânienne est survenue avant la métastase extracrânienne. (B) Nombre de CpG différentiellement méthylés par rapport au statut de traitement des métastases de patients individuels. (C) Nombre de CpG différentiellement méthylés par rapport à la survie des métastases intracrâniennes. Le patient P39 était toujours en vie et est marqué d'un astérisque '*'.

Pour étudier plus avant les changements de méthylation prédits entre les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes au niveau des gènes, les gènes les plus fréquemment affectés ont été déterminés en tenant compte d'un nombre minimal de patients chez lesquels ces gènes ont été modifiés dans la même direction (Fig. 5A). Comme on pouvait s'y attendre de l'hétérogénéité des méthylomes chez les patients, le nombre de gènes candidats a diminué pour un nombre croissant de patients qui devaient partager un gène spécifique. En outre, le nombre de gènes candidats avec une méthylation réduite était toujours supérieur au nombre de gènes candidats avec une méthylation accrue, ce qui était également attendu car une diminution de la méthylation se produisait plus fréquemment dans les métastases intra-crâniennes que dans les métastases extracrâniennes (Fig. 3A). De plus, aucun gène n'a été altéré dans le même sens chez tous les patients. Par conséquent, un seuil d'au moins 8 patients a été considéré pour caractériser les gènes les plus fréquemment altérés chez plus de 50 % des patients. L'ensemble de gènes candidats correspondant contenait 299 gènes dont 280 présentaient une diminution et 19 présentaient une méthylation accrue dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes (tableau supplémentaire S7). Compte tenu des voies de signalisation pertinentes pour le cancer connues, le plus grand chevauchement de ces gènes a été observé pour la voie de la jonction d'adhérence (6% des gènes candidats), suivie de la signalisation hedgehog (4, 1%) et mTOR (3, 9%) (Fig. 5B). De plus, pour la signalisation MAPK, PI3K/Akt et ECM, qui s'étaient précédemment révélées considérablement enrichies dans l'analyse individuelle des paires de métastases spécifiques au patient, environ 2,8 % des gènes candidats chevauchaient chacune de ces trois voies. Cependant, pour la voie de signalisation des cytokines, qui était le plus souvent enrichie dans l'analyse individuelle des paires de métastases, seul un chevauchement d'environ 1 % a été observé dans cette analyse intégrative de tous les patients. Ainsi, les gènes de la voie de signalisation des cytokines sont affectés par les changements de méthylation chez les patients individuels, mais la majorité des gènes affectés ont tendance à différer entre les patients. Pourtant, d'importants gènes de signalisation des cytokines tels que GDF15 avec une diminution de la méthylation intracrânienne et BMP4 avec une augmentation de la méthylation intracrânienne ont été modifiés chez au moins 8 patients. Dans l'ensemble, l'ensemble de gènes candidats était significativement enrichi pour les gènes connus du recensement du cancer (par exemple SGK1, MECOM, PRKCB) et les co/facteurs de transcription connus (par exemple CACNA2D3, BMP4) (Fig. 5C).

Aperçu général des gènes candidats avec une méthylation altérée entre les paires de métastases intra- et extracrâniennes. (A) Nombre de gènes candidats avec une méthylation diminuée (bleu) et augmentée (rouge) dans les métastases intracrâniennes qui ont été identifiées chez au moins un nombre spécifique de patients (axe des x) par rapport à leurs métastases extracrâniennes correspondantes. (B–D) Analyse des annotations génétiques des gènes candidats qui ont été modifiés dans le même sens chez au moins 8 patients. (B) Pourcentages de gènes affectés de voies de signalisation spécifiques parmi les gènes candidats qui ont montré une méthylation différentielle. (C) Pourcentages de gènes candidats dans les catégories générales d'annotations fonctionnelles. Les catégories significativement surreprésentées sont indiquées en rouge (valeur de p ajustée au FDR < 0,05). (D) Top termes d'ontologie génique surreprésentés au seuil de signification de - log\(_{10}\)(valeur q) > 2 représentant la fonction moléculaire (vert) et la composition cellulaire (orange).

En plus de cette analyse d'annotation de base, une analyse d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) a été effectuée pour l'ensemble de gènes candidats (Fig. 5D). Fait intéressant, les termes fonctionnels liés aux activités des canaux et des transporteurs (activités des canaux cationiques, activités des canaux voltage-dépendants) figuraient parmi les termes de fonction moléculaire GO les mieux classés. De plus, les composants cellulaires tels que les complexes de canaux ioniques et cationiques, les granules de pigment et les mélanosomes figuraient parmi les termes de composants GO les plus enrichis. Ces résultats pourraient indiquer un lien avec le phénotype de mélanome de type neurone qui a été décrit pour les métastases intracrâniennes26. De plus, les enrichissements des termes GO en relation potentielle avec un phénotype de type neurone étaient encore plus forts pour un ensemble de gènes candidats plus large de 1222 gènes qui ont été modifiés dans la même direction chez au moins 7 des 14 patients (Fig. S4 supplémentaire).

Enfin, les régions génomiques qui avaient été signalées comme étant altérées dans leur méthylation de l'ADN dans les métastases par rapport aux lignées cellulaires de mélanome primaire appariées37,38 ont été analysées pour leur comportement de méthylation dans nos métastases intra- et extracrâniennes appariées. Pour l'étude de Vizoso et al.37, 2410 des 2620 CpG dont la méthylation différait entre les lignées cellulaires de mélanome métastatique et primaire ont été partagés avec notre ensemble de données sur le méthylome (tableau supplémentaire S8). Ces CpG étaient associés à 1549 gènes qui se comportaient en termes d'altérations de la méthylation entre les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes appariées par les patients, très similaires à l'analyse globale de tous les gènes, ce qui signifie qu'un plus grand nombre de ces gènes présentaient une diminution plutôt qu'une augmentation de la méthylation dans les métastases intra- et extracrâniennes comparées. aux métastases extracrâniennes (Fig. S5A supplémentaire). En outre, le meilleur gène candidat TBC1D16, qui s'est avéré avoir perdu sa méthylation dans les lignées cellulaires métastatiques pour déclencher une cascade métastatique37, a également montré une diminution de la méthylation dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes pour 10 des 14 patients. Ainsi, TBC1D16 pourrait donc aussi potentiellement avoir un rôle important dans le développement de métastases intracrâniennes. Une analyse similaire a été effectuée pour les 23 gènes associés aux 10 régions hyper- et aux 65 régions hypométhylées de Chatterjee et al.38 qui avaient été identifiées pour distinguer les lignées cellulaires métastatiques des lignées cellulaires primaires de mélanome appariées (tableau supplémentaire S9), mais aucune des ces gènes ont montré une méthylation altérée chez plus de cinq patients comparant des métastases intra-crâniennes et extracrâniennes appariées (Fig. S5B supplémentaire).

L'ensemble initial de gènes candidats a été réduit aux 17 gènes de la voie de signalisation inclus qui ont été modifiés dans la même direction chez au moins 8 des 14 patients pour permettre une analyse ciblée des gènes sélectionnés de la voie de signalisation des cytokines, ECM, MAPK et PI3K/Akt. . Les changements de méthylation correspondants entre les paires de métastases intra- et extracrâniennes sont illustrés à la Fig. 6 pour les CpG spécifiques aux gènes associés. La grande majorité de ces CpG était située dans les corps de gènes (88,9 %), suivie par des proportions nettement plus faibles dans les régions promotrices (6,7 %) et activatrices (4,4 %). La carte thermique de la Fig. 6 représente en outre une forte séparation des paires de métastases en deux sous-clusters principaux, où le plus petit sous-cluster du côté droit (8 paires) montre principalement des niveaux de méthylation accrus dans les métastases intracrâniennes par rapport au plus grand sous-cluster du côté gauche. (14 paires). Ces deux groupes principaux n'étaient pas séparés par le type de tissu dans lequel les métastases extracrâniennes se sont produites, mais les quatre paires de métastases du patient P67 étaient incluses dans le sous-groupe droit. Cela a principalement contribué à la taille du sous-cluster droit, mais également des échantillons d'autres patients (P03, P06, P18, P42) ont été inclus. Néanmoins, d'autres échantillons de ces quatre patients faisaient partie du sous-groupe gauche indiquant que les altérations de la méthylation des gènes candidats peuvent différer entre des régions histologiques distinctes de métastases spécifiques au patient. En outre, des changements de méthylation cohérents ont été observés pour plusieurs CpG associés au même gène. Cela se traduit par un positionnement proche des CpG spécifiques des gènes dans le clustering. Seuls trois CpG de deux gènes candidats (BMP4, MECOM) avaient tendance à montrer une méthylation accrue sur toutes les paires de métastases, tandis que les autres CpG présentaient des différences de méthylation beaucoup plus fortes entre les deux groupes.

Carte thermique des rapports log\(_2\) des niveaux de méthylation des CpG associés aux 17 gènes candidats de la voie de signalisation qui distinguent le mieux les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes. Les ratios log\(_2\) quantifient les changements de méthylation dans la métastase intra-crânienne par rapport à la métastase extracrânienne correspondante pour chaque paire de métastases appariées. Le codage couleur des noms d'échantillons sous les colonnes de la carte thermique représente les tissus dans lesquels les métastases extracrâniennes se sont produites (bleu : poumon, vert : ganglion lymphatique, jaune : peau, violet : tissus mous, rose : foie). Les noms de gènes associés aux CpG individuels sont affichés le long des lignes sur le côté droit de la carte thermique. Les noms de gènes sont encore étendus par les identifiants CpG sous-jacents. L'emplacement de chaque CpG par rapport à son gène associé est affiché sur le côté gauche de la carte thermique le long des lignes distinguant les régions du promoteur (violet), du corps du gène (marron) ou de l'amplificateur (vert). Les appartenances spécifiques à la voie des gènes candidats sont également indiquées sur le côté gauche.

De plus, les 17 gènes candidats de la voie de signalisation ont été pris en compte pour une analyse d'annotation approfondie et une recherche documentaire afin de résumer les fonctions et les liens potentiels avec le cancer et d'autres maladies (tableau 2). Globalement, les 17 gènes candidats peuvent être principalement attribués à quatre groupes d'annotations fonctionnelles : (i) gènes impliqués dans la signalisation cellule-cellule (PRKCA, CACNG8, RASGRF1, CACNA2D3), (ii) gènes impliqués dans la croissance cellulaire (DUSP6, IGF1R, GDF15 , BMP4), (iii) des gènes impliqués dans la mort cellulaire (SGK1, MECOM), et (iv) des gènes impliqués dans la régulation de l'adhésion cellulaire (TNXB, ITGB7, TNR). En outre, de solides liens de la littérature avec le cancer ont été trouvés pour dix gènes candidats. La plupart de ces gènes étaient associés à des cancers des systèmes métaboliques (DUSP6, SGK1, BMP4, RASGRF1, GDF15) suivis du cancer du sein (CACNA2D3, ITGB7), des cancers du système nerveux central (PRKCA) ou de la leucémie (MECOM, JAK3). Certains des gènes candidats sont également connus pour jouer un rôle dans des maladies neuronales comme la maladie d'Alzheimer (EIF4B), la schizophrénie (CACNG8) ou la maladie de Parkinson (TNR).

Les 17 gènes de la voie de signalisation identifiés qui distinguaient le mieux les métastases intra-crâniennes des métastases extracrâniennes présentaient principalement des altérations de la méthylation du corps du gène (Fig. 6, Tableau 2). Pour analyser si et comment ces altérations de la méthylation du corps génique pourraient être associées à l'expression de ces gènes, des mesures d'expression génique normalisées des métastases appariées aux patients de 8 des 14 patients considérés de notre cohorte étaient disponibles pour une évaluation systématique de 13 gènes (Supplémentaire Tableau S10). Une représentation conjointe de ces données d'expression génique avec les données de méthylation du corps de gène correspondantes a suggéré une séparation de ces gènes en trois catégories de relations de données plus générales (Fig. 7A): (i) la majorité des gènes avec une diminution de la méthylation du corps de gène a montré une tendance vers une expression accrue dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes (8 des 11 gènes : CACNA2D3, DUSP6, EIF4B, GDF15, IGF1R, PRKCA, RASGRF1, SGK1), (ii) les trois autres gènes avec une diminution de la méthylation du corps du gène ont montré une tendance à une diminution l'expression dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes (3 des 11 gènes : JAK3, TNR, TNXB), et (iii) les deux gènes avec une méthylation accrue du corps génique (BMP4, MECOM) ont montré une tendance à la diminution de l'expression dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes . De plus, un classement de ces 13 gènes en fonction de leurs différences d'expression entre les métastases intra- et extracrâniennes appariées par le patient a montré que JAK3, MECOM et TNXB en particulier différaient fortement dans leur expression entre les métastases intra- et extracrâniennes (Fig. 7B – D , valeur p ajustée FDR < 0,05). Ainsi, cette étude de validation indique que les altérations de la méthylation du corps génique pourraient être fonctionnellement liées aux changements d'expression des gènes affectés et pourraient ainsi contribuer aux différences entre les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes.

Comportement d'expression de gènes candidats sélectionnés pour la voie de signalisation avec une méthylation modifiée du corps du gène qui distinguent le mieux les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes sur la base des données de méthylation. (A) Boîtes à moustaches représentant les différences de méthylation du corps génique (brun clair) et les différences d'expression génique (rouge) basées sur des rapports log \ (_2 \) comparant les mesures spécifiques aux gènes des métastases intra-crâniennes à extracrâniennes compte tenu des données disponibles de huit patients. Les noms de gènes sont affichés sous les paires de boîtes à moustaches. Deux lignes noires verticales ont été insérées dans le tracé pour permettre une meilleure séparation visuelle des gènes en trois classes qui diffèrent par leur comportement de méthylation et d'expression des gènes attribués. (B – D) Boxplots des niveaux d'expression intra- et extracrâniens des trois gènes avec la plus grande différence d'expression par rapport à zéro dans le sous-panneau (A). Les trois gènes ont été sélectionnés au seuil de valeur p ajusté au FDR de 0,05. Les valeurs P ont été obtenues par des tests t appariés comparant les niveaux d'expression spécifiques aux gènes des paires de métastases intra- et extracrâniennes appariées par les patients.

Le développement de métastases de mélanome intracrânien est un facteur crucial pour la survie des patients atteints de mélanome. Par conséquent, l'identification des différences moléculaires entre les métastases intra- et extracrâniennes est une étape très importante vers une meilleure caractérisation des altérations moléculaires qui peuvent contribuer à la résistance au traitement des métastases de mélanome intracrânien. Étant donné que des altérations épigénétiques pourraient potentiellement être impliquées dans l'établissement et la manifestation de différences moléculaires entre les métastases intra- et extracrâniennes22,67, nous nous sommes concentrés sur une analyse approfondie des méthylomes à l'échelle du génome de paires appariées de métastases de mélanome intra- et extracrâniennes. . L'analyse initiale de regroupement hiérarchique de ces méthylomes a clairement montré que l'origine spécifique au patient des métastases individuelles avait une plus forte influence sur le méthylome que l'organe dans lequel une métastase a été trouvée. Cela a également été confirmé par un regroupement hiérarchique supplémentaire de paires de métastases appariées par des patients provenant de patients pour lesquels des échantillons de différentes régions histologiques de métastases spécifiques au patient étaient disponibles. Un tel impact de l'ascendance spécifique au patient des métastases a également été récemment rapporté pour les profils d'expression génique des métastases de mélanome25. Pour tenir compte de cela, nous avons utilisé une approche HMM à trois états bien établie pour effectuer une analyse spécifique au patient de chaque paire de métastases individuelles. Cela nous a permis de prédire le statut de méthylation biologiquement plausible sous-jacent le plus probable pour chaque CpG de chaque paire de métastases individuelles.

Nous avons observé une tendance générale à la diminution de la méthylation dans les métastases de mélanome intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes au niveau des CpG individuels et au niveau des gènes affectés. Cette perte de méthylation a été retrouvée pour la plupart des paires appariées, mais plusieurs autres ont également montré un comportement plus équilibré entre les pertes et les gains de méthylation ou une nette augmentation de la méthylation dans les métastases intracrâniennes. Ainsi, le rôle potentiel des altérations du méthylome dans le développement des métastases du mélanome semble être très complexe et varier d'un patient à l'autre. Pourtant, la réduction globale plus fréquemment observée des niveaux de méthylation dans les métastases intracrâniennes peut représenter un mécanisme d'adaptation spécifique de ces métastases au micro-environnement spécifique du cerveau. Une telle adaptation serait également étayée par le fait général qu'une perte de méthylation peut jouer un rôle important dans la formation et la progression des tumeurs en influençant la stabilité génomique et l'expression des gènes68,69,70.

Comme suggéré par le regroupement hiérarchique et comme identifié plus en détail par les prédictions basées sur HMM des états de méthylation des CpG individuels, les méthylomes des métastases individuelles étaient très spécifiques au patient. Des comparaisons supplémentaires des prédictions basées sur le HMM des altérations du méthylome de plusieurs paires de métastases du même patient à des paires de métastases d'autres patients ont clairement confirmé ces altérations spécifiques au patient des méthylomes. Cette observation est en bon accord avec les résultats pour les méthylomes des métastases cérébrales de mélanome35. En raison de la forte hétérogénéité des patients et du petit nombre de patients, il n'est pas très surprenant qu'aucune association des altérations prédites du méthylome n'ait pu être trouvée en relation avec la survie ou le traitement des patients. Étant donné que les paires de métastases spécifiques au patient au sein de la cohorte ont été sélectionnées en se concentrant sur les patients dont les métastases se sont produites dans des délais comparables, il est seulement possible de dire que de relativement peu à de nombreuses altérations de la méthylation (1,8 à 26,2 % de tous les CpG d'un patient ont été méthylés de manière différentielle) peuvent survenir dans des délais similaires entre les métastases extra- et intracrâniennes. Une autre observation importante était que les CpG les plus discriminants qui distinguaient les métastases intra-crâniennes des métastases extracrâniennes avaient tendance à montrer des altérations de méthylation largement homogènes pour les patients traités et non traités, ce qui suggère qu'ils pourraient représenter des candidats marqueurs plus généraux indépendamment du statut du traitement.

En outre, une analyse d'annotation fonctionnelle des altérations prédites du méthylome a montré plusieurs modèles intéressants parmi les paires de métastases appariées par les patients. La méthylation différentielle a été observée à l'échelle du génome et les éléments génomiques fonctionnels tels que les promoteurs, les activateurs et les corps de gènes ont été significativement affectés. De plus, une perte de méthylation dans les métastases intracrâniennes a été révélée pour les familles de transposons, principalement pour les transposons à longues répétitions terminales (LTR) (12 paires sur 24). Une telle hypométhylation peut déclencher une réactivation des transposons, ce qui pourrait contribuer à des mutations supplémentaires de l'ADN71 et ainsi influencer le développement du cancer72. Au niveau des voies de signalisation pertinentes pour le cancer, principalement les gènes de MAPK, PI3K/Akt, ECM et la signalisation des cytokines étaient fréquemment affectés par une perte de méthylation dans les métastases intracrâniennes. La signalisation MAPK et PI3K/Akt, qui sont impliquées dans la régulation de la prolifération et de la survie cellulaire, sont déjà connues pour leurs rôles importants dans la régulation de la prolifération des métastases cérébrales du mélanome5,6,7,22,23. Les deux voies sont ciblées par des médicaments tels que les inhibiteurs de BRAF et de PI3K pour le traitement du mélanome métastatique24,73,74,75,76. La voie de signalisation des cytokines joue un rôle important dans les réponses immunitaires et est en outre connue pour être impliquée dans la progression tumorale77,78. Fait intéressant, 13 des 24 paires de métastases ont montré un enrichissement en diminution des altérations de la méthylation des gènes de la voie des cytokines, indiquant que cette voie pourrait être impliquée dans la manifestation de différences entre les métastases intra- et extracrâniennes spécifiques au patient. Cependant, les gènes de la voie des cytokines n'étaient pas significativement enrichis parmi les gènes candidats qui partageaient le même état de méthylation chez au moins 50 % des patients. Ainsi, différents gènes de la voie des cytokines sont affectés par les changements de méthylation chez les patients individuels.

Compte tenu de l'ensemble de gènes candidats dont on a observé qu'ils avaient le même statut de méthylation chez au moins 50% des patients, les gènes étaient souvent associés à des termes d'ontologie de type neurone comme les synapses et les canaux voltage-dépendants. Étant donné que les régions analysées des métastases ont été marquées par un pathologiste expérimenté, seule une contamination minimale par des cellules cérébrales normales est attendue, ce qui ne peut expliquer les fortes associations de type neurone observées. Ainsi, les altérations de la méthylation dans les métastases intracrâniennes peuvent avoir contribué à un phénotype semblable au cerveau, soutenant des découvertes antérieures similaires26,79. De plus, certains de ces gènes candidats individuels ont également montré des associations fréquentes avec des maladies neurodégénératives. Cela pourrait indiquer des adaptations partagées au microenvironnement cérébral.

De plus, l'ensemble de gènes candidats a été réduit à des gènes connus de la voie de signalisation du cancer pour permettre une analyse approfondie des 17 gènes candidats résultants (tableau 2). Le regroupement hiérarchique correspondant des CpG associés aux gènes a révélé deux groupes principaux (Fig. 6). Les deux clusters partageaient trois CpG avec une méthylation accrue dans les métastases intracrâniennes appartenant à deux gènes, BMP4 et MECOM. BMP4 est un facteur de croissance qui joue également un rôle essentiel dans la neurogenèse80. L'augmentation observée de la méthylation du corps génique de BMP4 dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extra-crâniennes était associée à une diminution de l'expression dans les métastases intracrâniennes, ce qui peut contribuer à des différences de croissance et de prolifération cellulaires entre les métastases intra-crâniennes et extracrâniennes. MECOM est un oncogène bien connu impliqué dans la prolifération cellulaire et l'apoptose et signalé comme étant surexprimé, par exemple dans la leucémie62,81, le cancer de l'ovaire82 et le glioblastome83. Encore une fois, l'augmentation observée de la méthylation du corps génique de MECOM était associée à une diminution de l'expression dans les métastases intracrâniennes, ce qui peut contribuer à des différences dans la manifestation et la progression des métastases entre les métastases intra et extracrâniennes. Tous les autres CpG différaient dans leur méthylation entre les deux groupes. Le plus grand groupe a montré principalement une diminution de la méthylation des CpG dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes, tandis que le plus petit groupe a montré un comportement de méthylation plus hétérogène des CpG individuels, y compris une augmentation et une diminution de la méthylation dans les métastases intracrâniennes. De plus, la plupart des CpG associés aux gènes (88,9 %) étaient situés dans la région du corps du gène, alors que seulement 6,7 % étaient associés à la région du promoteur du gène. Ainsi, les altérations des schémas de méthylation du corps génique semblent être une caractéristique importante pour distinguer les paires de métastases intra- et extracrâniennes. En plus de nos altérations observées et d'autres altérations potentiellement existantes des niveaux d'expression génique des gènes affectés34, de telles altérations du corps génique peuvent également avoir un impact sur l'épissage84. Cependant, il est important de noter que la différence observée dans les proportions d'altérations du corps du gène et de la méthylation du promoteur est également influencée par le fait que le microréseau sous-jacent représente plus de CpG dans les régions du corps du gène (56,6 %) que dans les régions du promoteur (13,7 %) . Néanmoins, nos analyses approfondies d'annotation génique des gènes de la voie de signalisation les plus fréquemment altérés suggèrent que les métastases intra- et extracrâniennes diffèrent potentiellement dans la signalisation cellule-cellule, l'adhésion cellulaire, la croissance cellulaire et la mort cellulaire. Certains des gènes identifiés peuvent donc également contribuer aux différences connues dans l'efficacité du traitement des métastases intra- et extracrâniennes.

En outre, une analyse des régions génomiques dont la méthylation a été précédemment signalée entre des lignées cellulaires de mélanome métastatique et primaire appariées37 a montré que les gènes associés à ces régions peuvent également être modifiés dans leur méthylation chez des paires d'intra- et métastases extracrâniennes. En particulier, le gène candidat de premier rang TBC1D16 trouvé par Vizoso et al.37 a également montré une diminution de la méthylation dans les paires de métastases intra-crâniennes et extracrâniennes appariées chez plus de 70 % des patients. Ainsi, la perte de méthylation de TBC1D16 dans les lignées cellulaires de mélanome métastatique qui a été signalée comme déclenchant une cascade métastatique37 pourrait également être impliquée dans la manifestation de différences entre les métastases intra- et extracrâniennes.

De plus, les altérations de la méthylation du corps génique des gènes de la voie de signalisation qui distinguaient le mieux les métastases intra-crâniennes des métastases extracrâniennes étaient directement associées aux changements d'expression. Un petit ensemble de données de validation de l'expression génique a permis d'analyser le comportement d'expression de 13 gènes de la voie de signalisation de premier rang sur la base de huit patients de notre cohorte. Trois catégories de relations de données pour les associations entre la méthylation du corps du gène et les changements d'expression ont été trouvées. Dans la plupart des cas, une diminution de la méthylation du corps du gène était associée à une expression accrue du gène affecté (CACNA2D3, DUSP6, EIF4B, GDF15, IGF1R, PRKCA, RASGRF1, SGK1), mais il y avait aussi trois gènes avec une diminution de la méthylation du corps du gène qui étaient associés avec une expression diminuée dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extra-crâniennes (JAK3, TNR, TNXB). Les deux gènes avec une méthylation accrue du corps du gène étaient associés à une diminution de l'expression dans les métastases intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes (BMP4, MECOM). Ainsi, la méthylation du corps du gène peut potentiellement influencer l'expression des gènes affectés, mais les relations potentielles entre la méthylation et les altérations de l'expression étaient complexes et spécifiques au gène. Cependant, TNXB, MECOM et JAK3 étaient les trois gènes de premier rang avec une méthylation du corps du gène altérée qui différaient significativement dans leur expression entre les métastases intra- et extracrâniennes appariées par les patients. Étant donné que ces trois gènes sont connus pour être impliqués dans la régulation de l'adhésion cellulaire, de la mort cellulaire ou des réponses immunitaires (tableau 2), les altérations de la méthylation du corps génique de ces gènes peuvent contribuer aux différences d'expression observées et donc potentiellement être impliquées dans l'établissement et manifestation de différences entre les métastases intra- et extracrâniennes.

Dans l'ensemble, notre étude représente la première analyse personnalisée à l'échelle du génome des profils de méthylation de l'ADN qui contribue à une caractérisation améliorée et plus détaillée des différences épigénétiques entre les métastases de mélanome intra- et extracrâniennes appariées par les patients. Une telle analyse personnalisée tient compte de l'hétérogénéité des patients et représente une première étape importante vers une meilleure stratification des patients individuels présentant des métastases de mélanome. Cependant, nos résultats d'altération du méthylome sont basés sur 14 patients et devraient donc être davantage validés dans de futures études avec des paires de métastases spécifiques au patient de patients supplémentaires. Les voies de signalisation modifiées identifiées et les gènes candidats sélectionnés peuvent fournir une base pour d'autres études expérimentales afin d'analyser l'impact de ces découvertes sur l'expression des gènes et des protéines à l'échelle du génome afin de déterminer les cibles potentielles pour le développement de thérapies améliorées pour les métastases intracrâniennes de mélanomes.

Les profils de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome des métastases de mélanome intra- et extracrâniennes appariées de l'un de nos projets antérieurs ont été utilisés pour déterminer les altérations du méthylome spécifiques au patient (Gene Expression Omnibus (GEO): GSE203152). La partie considérée de cet ensemble de données comprenait des profils de méthylation de 37 échantillons de métastases provenant de 14 patients atteints de mélanome. Chacun de ces patients a eu une métastase de mélanome intracrânien et extracrânien au cours de la maladie. Pour sept patients, plusieurs échantillons provenant de régions histologiquement différentes de la même métastase ont été pris en compte. Des informations détaillées sur les différents types de métastases et les données cliniques sont résumées dans le tableau 1. Les profils de méthylation considérés ont été mesurés sur des puces IlluminaHuman Methylation EPIC suivies d'un prétraitement dans R (paquets R minfi, IlluminaHumanMethylation450kmanifest et IlluminaHumanMethylation-EPICanno.ilm10b2.hg1985) en combinaison avec normalisation par la fonction R preprocessFunnorm utilisant le sexe des patients. Les CpG qui étaient représentés par des sondes sur le microréseau ont ensuite été filtrés pour les sondes polymorphes et hors cible sur la base des données de86. Les rapports log \ (_2 \) comparant les signaux d'hybridation méthylés aux signaux d'hybridation non méthylés ont été calculés pour chacun des 836 320 CpG de chaque échantillon (tableau supplémentaire S1).

Les rapports CpG-log \ (_2 \) spécifiques à l'échantillon comparant les signaux d'hybridation méthylés aux signaux d'hybridation non méthylés (tableau supplémentaire S1) ont été utilisés pour effectuer une analyse de regroupement hiérarchique des méthylomes des métastases individuelles à l'aide du package R pvclust39. La distance de Manhattan a été choisie comme métrique de distance entre les échantillons individuels en raison de la grande dimensionnalité des données87 en combinaison avec la méthode de liaison à variance minimale de Ward (ward.D2)88 pour le regroupement. L'approche pvclust a été utilisée avec 10 000 répétitions de bootstrapping afin d'analyser la stabilité du clustering. Cette stabilité a été quantifiée à l'aide de la valeur p approximative sans biais (valeur AU). Cette valeur est comprise entre 0 et 100, où une valeur plus élevée indique une plus grande stabilité. La même approche bootstrap a également été envisagée pour évaluer la robustesse des regroupements hiérarchiques des paires de métastases spécifiques au patient afin de déterminer les similitudes et les différences de plusieurs paires de métastases de différentes régions histologiques du même patient ou entre patients (Fig. S1 supplémentaire).

Pour obtenir un rapport de méthylation log\(_2\) pour chaque CpG d'une paire de métastases spécifiques au patient, la mesure de méthylation spécifique de CpG obtenue de la métastase extracrânienne a été soustraite de la mesure de méthylation de métastase intracrânienne correspondante. Les rapports de log\(_2\)-méthylation ont ensuite été classés en fonction des emplacements chromosomiques des CpG individuels afin d'obtenir un profil de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome pour chaque paire de métastases spécifiques au patient (tableau supplémentaire S2). Les rapports log\(_2\) sous-jacents précisent la différence de méthylation entre les métastases intra-crâniennes et extracrâniennes pour chaque patient et contiennent les informations suivantes : (i) des rapports log\(_2\) clairement inférieurs à zéro indiquent une diminution de la méthylation dans les métastases intracrâniennes métastases, (ii) des rapports log\(_2\) proches de zéro indiquent une méthylation inchangée, et (iii) des rapports log\(_2\) clairement supérieurs à zéro indiquent une augmentation de la méthylation dans la métastase intracrânienne par rapport aux patients correspondants appariés métastase extracrânienne. Étant donné que les CpG voisins à proximité chromosomique avaient des mesures similaires (Fig. 2), nous avons considéré un modèle de Markov caché (HMM) qui peut utiliser ces dépendances locales pour l'analyse des paires de métastases individuelles. Plus en détail, nous avons analysé les profils de méthylation du rapport log\(_2\) spécifiques au chromosome résultants d'une paire de métastases spécifiques au patient par un HMM standard à trois états de premier ordre avec des densités d'émission gaussiennes spécifiques à l'état spécifiquement développées pour l'analyse. des profils de méthylation de l'ADN40. Ce HMM utilise trois états pour classer chaque CpG selon son niveau de méthylation : (i) l'état "-" modélise les CpG avec une méthylation diminuée dans l'intracrânien par rapport à la métastase extracrânienne correspondante, (ii) l'état "\(=\)" modélise les CpG avec des niveaux de méthylation inchangés, et (iii) l'état "\(+\)" modélise les CpG avec une méthylation accrue dans l'intracrânien par rapport à la métastase extracrânienne correspondante. Motivé par la distribution des rapports log \ (_2 \) pour la comparaison des métastases intra- et extracrâniennes appariées par les patients (Fig. S6 supplémentaire), les moyennes initiales des distributions d'émission gaussiennes spécifiques à l'état ont été fixées à - 3, 0 , et 3 et les écarts-types initiaux correspondants ont été fixés à 0,3, 0,5 et 0,3 pour les états "-", "\(=\)" et "\(+\)", respectivement. De plus, les probabilités d'état initiales ont été fixées à 0,1 pour les états "-" et "\(+\)" et à 0,8 pour l'état "\(=\)" pour tenir compte du fait que la grande majorité des CpG avaient tendance à être inchangés. . Ensuite, le HMM initial a été formé en utilisant tous les profils de méthylation de rapport log\(_2\) appariés par les patients à l'aide de l'algorithme bayésien de Baum-Welch qui permet d'intégrer les connaissances préalables sur les différences de méthylation attendues dans la formation. Pour réaliser cela, une recherche de grille a été utilisée pour déterminer les paramètres d'hyperparamètres pour les densités d'émission gaussiennes spécifiques à l'état afin de permettre une interprétation biologiquement significative des états du HMM formé. Cette recherche a été utilisée pour minimiser le nombre de CpG potentiellement mal classés avec des rapports log\(_2\) négatifs assignés à l'état "\(+\)" ou des CpG avec des ratios log\(_2\) positifs assignés à l'état "− " tout en maximisant le nombre total de CpG affectés à l'état "\(+\)" ou "-" pour obtenir une séparation claire des altérations de méthylation. Une bonne séparation entre les niveaux de méthylation réduits, inchangés et accrus des CpG a été obtenue en fixant les valeurs du paramètre d'échelle (scaleMeans) à 1e+06, 1e+03, 1e+06 et celles du paramètre de forme (shapeSds) à 5e +05, 10, 5e+05 pour les états "−", "\(=\)" et "\(+\)", respectivement. Tous les autres hyperparamètres ont été maintenus aux normes prédéfinies. La formation du HMM sur tous les profils de méthylation du rapport log\(_2\) appariés aux patients a garanti que les prédictions du HMM restaient comparables entre les patients. La formation a pris 98 étapes d'itération qui ont été effectuées en 40 minutes environ sur un ordinateur portable standard (CPU : 1,80 GHz, 8 Go de RAM) en utilisant l'implémentation HMM de base basée sur le fichier Java JAR de89. Le décodage d'état postérieur a été utilisé pour attribuer chaque CpG dans un profil de méthylation de rapport log\(_2\) spécifique au patient à son état de méthylation sous-jacent le plus probable (tableau supplémentaire S3).

Chaque CpG a été annoté en fonction du chevauchement de sa localisation génomique avec la localisation des caractéristiques génomiques fonctionnelles. Les annotations de promoteur et de gène ont été obtenues à partir de la ressource de caractéristiques de régulation IlluminaHuman Methylation EPIC arrays90. Les annotations CpG-island ont été obtenues à partir du package R IlluminaHuman Methylation EPIC Cando85. Les annotations Enhancer ont été obtenues par le package R annotatr en utilisant les annotations de FANTOM5. Les gènes de signalisation et des voies métaboliques et les annotations des gènes liés au cancer ont été extraits de91. Les annotations transposon ont été obtenues à partir du navigateur de génome UCSC92. La signification statistique de l'enrichissement des CpG méthylés augmentés et diminués dans une catégorie fonctionnelle spécifique a été testée à l'aide d'un test exact de Fisher unilatéral (fonction R fisher.test). Toutes les catégories avec une valeur de p ajustée au FDR (fonction R p.adjust93) inférieure à 0,05 ont été considérées comme significativement enrichies.

Des méta-informations cliniques sur le temps écoulé entre les métastases appariées, le traitement et la survie étaient disponibles pour la plupart des patients (tableau supplémentaire S5). Ces données ont été utilisées pour rechercher des associations potentiellement existantes avec des altérations de la méthylation à l'échelle du génome qui ont été prédites par le HMM pour chaque paire de métastases appariées aux patients. Par conséquent, le nombre de CpG avec une méthylation accrue (état "\(+\)") et diminuée (état "-") dans la métastase intra-crânienne par rapport à la métastase extracrânienne a été calculé pour chaque paire. Sur cette base, le nombre de CpG différentiellement méthylés a été déterminé pour chaque paire en additionnant les deux comptages. Pour plusieurs paires de métastases d'un même patient, les nombres moyens d'augmentations et de diminutions ont été pris en compte. En outre, un score a été défini pour quantifier pour chaque patient si sa métastase intracrânienne avait des niveaux de méthylation plus élevés ou plus diminués des CpG par rapport à sa métastase extracrânienne correspondante. Cela a été fait pour chaque patient en divisant la différence entre le nombre de CpG avec une méthylation accrue et diminuée par la somme correspondante de CpG différentiellement méthylés. Le score résultant est toujours dans la plage de [-1, 1]. Des valeurs de score négatives précisent que plus de CpG avec des niveaux de méthylation diminués qu'avec des niveaux accrus de méthylation dans la métastase intracrânienne ont été observés pour un patient et des valeurs de score positives spécifient le contraire. Pour identifier les tendances potentiellement existantes, des diagrammes de dispersion ont été utilisés pour tracer le nombre de CpG différentiellement méthylés par rapport au temps entre les deux métastases, les groupes de traitement et le délai de décès à partir du diagnostic des métastases intracrâniennes.

Pour identifier les gènes candidats fréquemment affectés par les modifications de la méthylation de l'ADN, tous les CpG au sein de promoteurs, d'amplificateurs et de corps de gènes spécifiques à un gène ont été classés parmi tous les patients en fonction de leur nombre de diminution ou d'augmentation de méthylation prévues par le HMM (tableau supplémentaire S7). Pour les patients présentant plusieurs paires de métastases, chaque CpG d'un patient a été combiné à l'aide d'un vote majoritaire basé sur des prédictions diminuées et augmentées. Notez que dans ce contexte, 0,07 % de tous les CpG avaient un nombre égal de prédiction de méthylation diminuée et augmentée et n'étaient donc pas décidables et considérés comme une méthylation inchangée pour les exclure de l'analyse. Cela permet de ne considérer chaque patient qu'une seule fois dans le classement global CpG. Les promoteurs, les amplificateurs et les corps de gènes ont été pris en compte pour le classement des gènes, car ils se sont révélés considérablement enrichis dans l'analyse à l'échelle du génome des profils individuels de méthylation de l'ADN (Fig. 3B) et il est connu que ces éléments génomiques sont importants pour la régulation de l'expression des gènes94,95,96. Sur la base du classement des CpG associés aux gènes, un ensemble mondial de gènes les mieux classés a d'abord été déterminé en sélectionnant chaque gène qui avait au moins un CpG spécifique au gène correspondant prévu pour montrer une diminution ou une augmentation de la méthylation dans plus de 50% des patients (au moins 8 patients sur 14, tableau supplémentaire S7). Cela a abouti à 299 gènes candidats. Une analyse d'enrichissement de l'ontologie des gènes par clusterProfiler97 a été réalisée pour ces gènes afin d'obtenir une caractérisation globale des caractéristiques moléculaires qui diffèrent entre les métastases intra- et extracrâniennes. Par conséquent, les noms de gènes ont été mappés aux identifiants ENTREZ à l'aide de la fonction bitr de clusterProfiler (84 % des gènes présents sur le microréseau EPIC et 88 % des gènes les mieux classés étaient mappables). De plus, une annotation approfondie et une analyse de la littérature ont été effectuées pour les 17 gènes annotés de la voie de signalisation des gènes candidats à l'aide d'Uniprot66, GeneCards65 et Pubmed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/) afin d'obtenir des informations plus détaillées. un aperçu des différences potentiellement existantes entre les métastases intra- et extracrâniennes.

Les données d'expression génique pour 13 des 17 gènes candidats sélectionnés pour la voie de signalisation avec une méthylation altérée étaient disponibles dans un projet complémentaire pour analyser si et comment les altérations de la méthylation de l'ADN influencent l'expression de ces gènes. Cet ensemble de données de validation comprenait des mesures d'expression génique d'ARN-seq appariées aux patients traitées des métastases de mélanome intra- et extracrâniennes qui étaient disponibles pour 8 des 14 patients de notre cohorte de méthylation de l'ADN (tableau supplémentaire S10). Les ratios log\(_2\) d'expression génique ont été calculés pour chacun des 13 gènes pour chaque paire de métastases en soustrayant les niveaux d'expression log\(_2\) spécifiques aux gènes normalisés de la métastase extracrânienne du log\(_2\ correspondant )-niveaux d'expression de la métastase intracrânienne. Ces log\(_2\)-ratios permettent de caractériser le comportement d'expression de chaque gène : (i) des valeurs nettement inférieures à zéro indiquent une expression réduite, (ii) des valeurs proches de zéro indiquent une expression inchangée, et (iii) des valeurs nettement supérieures à zéro indiquent une expression accrue dans les métastases de mélanome intra-crâniennes par rapport aux métastases extracrâniennes. Pour déterminer pour chaque gène si son expression était significativement différente de zéro, un test t (fonction R t.test) a été utilisé et les valeurs p de tous les tests t ont été ajustées pour des tests multiples en calculant les valeurs p ajustées au FDR (R fonction p.adjust93). Il en est résulté trois gènes avec des valeurs p ajustées au FDR inférieures à 0, 05 (JAK3, MECOM, TNXB) pour lesquelles une comparaison directe supplémentaire des niveaux d'expression intra- et extracrânienne correspondant au patient a été effectuée par un test t apparié. Cette analyse supplémentaire a pris en compte de manière égale chacun des huit patients en considérant les niveaux moyens d'expression génique intra- ou extracrânienne pour les patients pour lesquels des mesures de plusieurs régions de la même métastase étaient disponibles (P04, P06, P08, P18, P42).

L'utilisation de matériel tumoral FFPE pour les analyses de méthylome et d'expression a été approuvée par le comité d'éthique de l'Université de Dresde (EK 48022018). Les études ont été menées conformément à la Déclaration d'Helsinki. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes. Un consentement éclairé pour l'utilisation du matériel tumoral a été obtenu de tous les patients inclus.

Les données brutes de méthylation de l'ADN sont disponibles auprès de Gene Expression Omnibus (GSE203152). Les profils de méthylation d'ADN traités des métastases individuelles sont fournis dans le tableau supplémentaire S1. Les profils de méthylation de l'ADN des paires de métastases appariées aux patients comparant les métastases intra-crâniennes aux extracrâniennes sont fournis dans le tableau supplémentaire S2. Le code R de l'étude réalisée est disponible gratuitement sur GitHub sous https://github.com/TheresaKraft/MelBrainSys_methylation.

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Nous remercions Antje Habel pour l'extraction de l'ADN avant le profilage de la méthylation de l'ADN et le Dr Melanie Bewerunge-Hudler de la Core Facility Genomics & Proteomics du DKFZ pour avoir effectué l'hybridation des puces de méthylome.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL. Ce projet a été soutenu par une subvention de recherche NCT Proof-of-Concept Trial (MS, FM), une subvention de recherche translationnelle NCT en oncologie de précision (MS, FM) et une subvention BMBF e:Med Junior Research Alliance du ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche. (FKZ : 01ZX1913A, DW ; FKZ : 01ZX1913B, MS). FM et DW reconnaissent également le soutien financier de la Hiege Stiftung gegen Hautkrebs.

Institut d'informatique médicale et de biométrie (IMB), Faculté de médecine Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 01307, Dresde, Allemagne

Theresa Kraft, Konrad Grützmann et Michael Seifert

Département de pathologie, Faculté de médecine Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 01307, Dresde, Allemagne

Matthieu Meinhardt

Département de dermatologie, Faculté de médecine Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 01307, Dresde, Allemagne

Friedegund Meier & Dana Westphal

Centre national des maladies tumorales (NCT), D-01307, Dresde, Allemagne

Friedegund Meier, Dana Westphal et Michael Seifert

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Conceptualisation : SEP ; Conservation des données : TK, DW, MM, KG, MS ; Analyse formelle : TK, MS ; Méthodologie : TK, MS ; Acquisition de financement : MS, DW, FM ; Administration du projet : MS ; Ressources : MS, DW, MM, FM ; Surveillance : MS ; Rédaction - brouillon original : TK, MS ; Rédaction - révision et édition : TK, KG, DW, MM, FM, MS

Correspondance avec Michael Seifert.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Kraft, T., Grützmann, K., Meinhardt, M. et al. Identification spécifique au patient des différences de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome entre les métastases de mélanome intracrâniennes et extracrâniennes. Sci Rep 13, 444 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24940-w

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Reçu : 14 juillet 2022

Accepté : 22 novembre 2022

Publié: 09 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24940-w

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